Avancées majeures en microscopie haute résolution

Des scientifiques dirigés par le lauréat du prix Nobel Stefan Hill à l’Institut Max Planck pour la recherche médicale à Heidelberg ont développé un microscope à super-résolution avec une résolution spatiale et temporelle d’un nanomètre par milliseconde. Une version améliorée de la microscopie MINFLUX à super résolution récemment introduite a permis d’observer de petits mouvements de protéines uniques avec un niveau de détail sans précédent : le mouvement par étapes de la protéine motrice kinésine-1 lorsqu’elle marchait le long des microtubules pendant la consommation d’ATP. L’ouvrage a été publié dans les sciencesmet en évidence la puissance de MINFLUX en tant que nouvel outil révolutionnaire pour surveiller les changements conformationnels de taille nanométrique dans les protéines.

Pour démêler le fonctionnement interne d’une cellule, il faut connaître la biochimie des protéines individuelles. Mesurer de petits changements dans leur position et leur forme est le défi central ici. La microscopie fluorescente, en particulier la microscopie à super-résolution (c’est-à-dire la nanoscopie) devient indispensable dans ce domaine émergent. MINFLUX, le système de nanoscopie à fluorescence récemment introduit, a déjà atteint une résolution spatiale de nanomètres à plusieurs nanomètres – la taille de petites molécules organiques. Mais faire passer notre compréhension de la physiologie moléculaire des cellules à un niveau supérieur nécessite des observations avec une résolution spatio-temporelle encore plus élevée.

Lorsque le groupe de Stefan Hell a introduit MINFLUX pour la première fois en 2016, il a été utilisé pour suivre les protéines marquées par fluorescence dans les cellules. Cependant, ces mouvements étaient aléatoires et le suivi avait une précision de l’ordre de la dizaine de nanomètres. Leur étude a été la première à appliquer le pouvoir de résolution de MINFLUX aux changements conformationnels des protéines, en particulier la protéine motrice kinésine-1. Pour ce faire, des chercheurs de l’Institut Max Planck pour la recherche médicale ont développé une nouvelle version de MINFLUX pour le suivi de molécules fluorescentes uniques.

Toutes les méthodes établies pour mesurer la dynamique des protéines ont des limitations sévères, entravant leur capacité à traiter la gamme (sub)nm/(sub)milliseconde. Certains offrent une résolution spatiale élevée, jusqu’à quelques nanomètres, mais ils ne peuvent pas suivre les changements assez rapidement. D’autres ont une résolution temporelle élevée mais nécessitent un marquage avec des billes de 2 à 3 ordres de grandeur plus grandes que la protéine étudiée. Étant donné que le fonctionnement de la protéine est susceptible d’être compromis par une bille de cette taille, les études utilisant des billes laissent des questions ouvertes.

Fluorescence d’une seule molécule

Cependant, MINFLUX ne nécessite qu’une molécule de fluorescence standard de 1 nm comme marqueur de liaison aux protéines et peut donc fournir la résolution et l’invasivité minimale nécessaires pour étudier la dynamique des protéines natives. « L’un des défis consiste à construire un microscope MINFLUX qui fonctionne près de la limite théorique et qui est à l’abri du bruit ambiant », déclare Otto Wolf, Ph.D. étudiant du groupe. « Concevoir des sondes qui n’affectent pas la fonction des protéines, mais révèlent le mécanisme biologique, c’est autre chose », ajoute son collègue Lukas Scheiderer.

Le microscope MINFLUX présenté par les chercheurs peut désormais enregistrer les mouvements des protéines avec une résolution spatio-temporelle de 1,7 nanomètres par milliseconde. La détection ne nécessite qu’environ 20 photons émis par la molécule fluorescente. « Je pense que nous ouvrons un nouveau chapitre dans l’étude de la dynamique des protéines individuelles et de la façon dont elles changent de forme au cours de leur fonctionnement », déclare Stefan Hill. « La combinaison de la résolution spatiale et temporelle élevée fournie par MINFLUX permettra aux chercheurs d’étudier les biomolécules comme jamais auparavant. »

Résoudre l’action progressive de la kinésine-1 avec l’ATP dans des conditions physiologiques

La kinésine-1 est un acteur clé du transport de marchandises à travers nos cellules, et les mutations protéiques sont au cœur de nombreuses maladies. En fait, la kinésine 1 « marche » le long des filaments (microtubules) qui s’étendent sur nos cellules comme un réseau de rues. On peut imaginer le mouvement comme littéralement « stepping », car la protéine a deux « têtes » qui changent alternativement de position sur les microtubules. Ce mouvement se produit normalement le long de l’un des 13 filaments primaires qui composent les microtubules et est alimenté par la dégradation de la principale ressource énergétique de la cellule, l’ATP (adénosine triphosphate).

En utilisant un seul fluorophore pour marquer la kinésine-1, les scientifiques ont enregistré des étapes normales de 16 nm pour les têtes individuelles plus 8 nm, avec une résolution spatio-temporelle nanométrique/milliseconde. Leurs découvertes ont démontré que l’ATP est absorbé lors de la fixation d’une tête aux microtubules, mais que l’hydrolyse de l’ATP se produit lorsque les deux têtes sont liées. Il a également révélé que l’étape implique la rotation de la «tige» de la protéine, qui fait partie de la molécule de kinésine porteuse de la charge utile. La résolution spatio-temporelle de MINFLUX a également révélé la rotation de la tête au stade initial de chaque étape. Remarquablement, ces résultats ont été obtenus en utilisant des concentrations physiologiques d’ATP, ce qui n’était pas encore possible en utilisant des micro-marqueurs fluorescents.

Ajoute Jessica Mathias, « Je suis ravie de voir où MINFLUX nous emmènera. Il ajoute une autre dimension à l’étude du fonctionnement des protéines. Cela peut nous aider à comprendre les mécanismes sous-jacents à de nombreuses maladies et, en fin de compte, contribuer au développement de traitements », a ajouté Jessica Mathias. chercheur postdoctoral qui était auparavant dans le groupe Hell, qui explore maintenant les applications du MINFLUX à une variété de questions biologiques.