Même de bons ajustements génétiques peuvent devenir mauvais

Newswise – HOUSTON – (24 octobre 2022) – Le laboratoire de l’Université Rice mène des efforts pour découvrir les menaces potentielles à l’efficacité et à la sécurité des thérapies médicamenteuses Cas CRISPR 9La J’ai le cadeau nobal La technologie d’édition de gènes, même lorsqu’elle semble fonctionner comme prévu.

ingénieur bio Gang Bao du riz École George R. Ingénierie brune et son équipe dans des recherches publiées dans progrès scientifique que si les modifications hors cible de l’ADN sont depuis longtemps une source de préoccupation, les changements invisibles qui accompagnent les modifications de la cible doivent également être reconnus – et quantifiés.

Bao a pointé un Article sur la biotechnologie de la nature 2018 A indiqué qu’il y avait de grandes suppressions. « C’est à ce moment-là que nous avons commencé à chercher ce que nous pouvions faire pour les quantifier, grâce aux systèmes CRISPR-Cas9 conçus pour répondre drépanocytose, » il a dit.

Bao a été un fervent partisan de CRISPR-Cas9 en tant qu’outil pour traiter la drépanocytose, une poursuite que lui et ses collègues ont menée. Plus proche que jamais guérir. Les chercheurs craignent désormais que d’importantes délétions ou d’autres changements non découverts dus à la modification génétique puissent persister dans les cellules souches au fur et à mesure qu’elles se divisent et se différencient, et avoir ainsi des effets à long terme sur la santé.

« Nous ne comprenons pas bien pourquoi quelques milliers de bases d’ADN peuvent disparaître au niveau du site de coupure Cas9 et les cassures double brin d’ADN peuvent encore être recombinées efficacement », a déclaré Bao. « C’est la première question, et nous avons quelques hypothèses. Et la seconde, quelles sont les conséquences biologiques ? De grandes délétions (LD) peuvent atteindre les gènes voisins et perturber l’expression du gène cible et des gènes voisins. On ne sait pas si les LD peut conduire à l’expression de protéines tronquées.

« Vous pouvez également avoir des protéines hétérologues ou des protéines avec un domaine supplémentaire en raison des grandes insertions », a-t-il déclaré. « Toutes sortes de choses peuvent arriver, et les cellules peuvent mourir ou avoir des fonctions anormales. »

Son laboratoire a mis au point une procédure qui utilise Séquençage d’une seule molécule en temps réel (SMRT) avec double Identifiants moléculaires uniques (UMI) pour trouver et quantifier les LD involontaires ainsi que les grandes insertions et les réarrangements chromosomiques locaux qui accompagnent les petites insertions/délétions (INDEL) au site de coupe cible Cas9.

« Pour estimer les modifications génétiques importantes, nous avons besoin d’une procédure à long terme PCRmais cela peut induire des artefacts lors de l’amplification de l’ADN « , a déclaré Bao. « Nous avons donc utilisé des UMI à 18 bases comme une sorte de code-barres. »

« Nous l’ajoutons aux molécules d’ADN que nous voulons amplifier pour déterminer une qualité spécifique Molécules d’ADN Comme moyen de réduire ou d’éliminer les artefacts dus à la polymérisation séquentielle à longue portée. » « Nous avons également développé un pipeline bioinformatique pour analyser les données de séquençage SMRT et mesurer les LD et les grandes insertions. »

L’instrument de laboratoire de Bao, appelé LongAmp-seq (long-amplicon séquence), identifie avec précision les petits et les grands INDEL. Contrairement à SMRT-seq, qui nécessite l’utilisation d’un séquenceur à lecture longue qui n’est souvent disponible que dans une installation de base, LongAmp-seq peut être effectué à l’aide d’un séquenceur à lecture courte.

Pour tester la stratégie, l’équipe du laboratoire dirigée par le diplômé Rice Parc Jollymaintenant professeur adjoint de bio-ingénierie, a utilisé Streptococcus pyogenes Cas9 pour modifier les activateurs de la bêta-globine (HBB), de la gamma-globine (HBG) et du lymphome à cellules B/leucémie 11A (BCL11A) dans Cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) de patients atteints de drépanocytose et le gène PD-1 dans les lymphocytes T primaires.

Ils ont découvert que de grandes délétions allant jusqu’à plusieurs milliers de bases se produisaient avec une fréquence élevée dans les HSPC : jusqu’à 35,4 % dans HBB, 14,3 % dans HBG et 15,2 % dans les gènes BCL11A, ainsi que sur le gène PD-1 (15,2 %). dans Cellules T.

Étant donné que deux des ARN de référence spécifiques de CRISPR testés par le laboratoire de Bao sont utilisés dans des essais cliniques pour traiter la drépanocytose, a-t-il déclaré, il est important de déterminer les conséquences biologiques des altérations génétiques importantes dues aux doubles cassures induites par Cas9.

Bao a déclaré que l’équipe de Rice cherche actuellement en aval pour analyser les conséquences des longues suppressions ARN رسول messager, l’intermédiaire qui porte le code des ribosomes pour la fabrication des protéines. « Ensuite, nous passons au niveau des protéines », a déclaré Bao. « Nous voulons savoir si ces grandes délétions et insertions persistent après la transplantation des HSPC génétiquement modifiés chez des souris et des patients »

المؤلفون المشاركون في الدراسة من رايس هم طلاب الدراسات العليا مينجمينج كاو وييلي فو ، وخريجو يدان بان وتيموثي ديفيس ، وأخصائي الأبحاث لافانيا ساكسينا ، وأخصائي الميكروسكوب / الآلات الحيوية هارشافاردان ديشموخ وتود ترينجين ، الأستاذ المساعد في علوم الكمبيوتر ، وفيفيان بجامعة إيموري شيهان ، أستاذة مساعدة في Pédiatrie.

Bao est le directeur du département et le professeur de bio-ingénierie de la famille Voight, professeur de chimie, science des matériaux, nano-ingénierie et génie mécanique, et chercheur au CPRIT dans la recherche sur le cancer.

Les National Institutes of Health (R01HL152314, OT2HL154977) ont soutenu la recherche.

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Lire le résumé en https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo7676.

Ce communiqué de presse est disponible en ligne sur https://news.rice.edu/news/2022/even-good-gene-edits-can-go-bad.

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Laboratoire Bao : http://bao.rice.edu

Département de bio-ingénierie du riz : https://bioengineering.rice.edu

George R. Collège. Ingénierie brune : https://engineering.rice.edu

Située sur un campus boisé de 300 acres à Houston, la Rice University a été régulièrement classée parmi les 20 meilleures universités du pays par US News & World Report. Rice possède des facultés d’architecture, de commerce, d’études continues, d’ingénierie, de sciences humaines, de musique, de sciences naturelles et de sciences sociales très respectées et abrite le Baker Institute for Public Policy. Avec 4 240 étudiants de premier cycle et 3 972 étudiants des cycles supérieurs, le ratio premier cycle-professeurs de Rice est d’un peu moins de 6 pour 1. Le système des collèges résidentiels crée des communautés soudées et des amitiés pour la vie, et ce n’est qu’une des raisons pour lesquelles Rice se classe première dans tant de ses interactions. Race/ségrégation et classement #1 pour la qualité de vie par Princeton Magazine. Rice est également classée comme la meilleure valeur parmi les universités privées par Kiplinger Personal Finance.