Les principaux systèmes d’édition de gènes de nouvelle génération élargissent les applications cliniques et de recherche de la technologie

Les chercheurs ont amélioré l’efficacité de l’édition primaire, une technologie d’édition de gènes polyvalente basée sur CRISPR, et ont utilisé le système amélioré pour corriger les mutations pathologiques dans les cellules.

Les scientifiques ont développé un ensemble d’outils moléculaires qui augmentent l’efficacité d’une technologie d’édition de gènes appelée édition primaire pour une variété de types de cellules et de gènes cibles, élargissant ainsi les applications thérapeutiques et de recherche de la technologie. Dans deux nouvelles études, les chercheurs ont utilisé des systèmes d’édition primaires améliorés pour corriger les mutations associées à plusieurs maladies neurodégénératives, métaboliques et cardiovasculaires.

Il a été décrit pour la première fois dans 2019L’édition primaire est une méthode précise d’édition de gènes qui a le potentiel de corriger la grande majorité des variations génétiques connues à l’origine de maladies. Les chercheurs peuvent utiliser l’édition initiale pour travailler ADN Substitutions, insertions et suppressions sur des sites cibles dans des cellules humaines et animales. Cependant, l’efficacité de l’édition varie en fonction du type de cellule en cours d’édition et du site cible dans le génome.

Pour développer davantage la technologie, les scientifiques du Broad Institute avec Et Harvard est une amélioration par rapport à un élément clé du système d’édition de base appelé ARN guidé par l’édition ou « pegRNA », qui codent la modification prévue et dirigent la machine d’édition initiale. Dans une étude publiée récemment dans biotechnologie naturelle, les chercheurs ont montré que les pegRNAs peuvent être dégradés dans les cellules, coupant les pegRNAs qui interfèrent avec l’édition initiale. Ils ont développé de nouveaux pegRNA qui sont protégés de la dégradation dans les cellules, ce qui a augmenté l’efficacité de l’édition à grande échelle.

Dans une deuxième étude publiée récemment dans celluleChercheurs extensifs, collaborant avec des scientifiques de université de Princeton et l’Université de Californie à San Francisco (UCSF), ont identifié les voies cellulaires qui limitent l’efficacité de l’édition primaire et ont utilisé ces informations pour développer la prochaine génération de systèmes d’édition primaire.

Dans les deux études, les chercheurs ont montré que les nouveaux systèmes pourraient modifier plus efficacement les mutations associées La maladie d’Alzheimer Maladie cardiaque, drépanocytose, maladie à prions, diabète de type 2 et autres maladies, avec moins de sous-produits indésirables produits.

David Liu, auteur principal des deux études, a déclaré le professeur Richard Merkin et directeur du Merkin Institute for Transformative Technologies in Health Care au Broad Institute, professeur à l’Université Harvard et chercheur au Howard Hughes Medical Institute.

Crédit : Broad Institute

Guide d’ingénierie plus stable

L’édition initiale permet aux scientifiques de corriger la grande majorité des mutations pathogènes connues – y compris les substitutions, les insertions ou les suppressions de plusieurs dizaines de paires de bases – à des emplacements spécifiques du génome. Contrairement à d’autres techniques d’édition du génome, l’édition primaire n’implique pas de couper les deux brins d’ADN et, par conséquent, réduit les risques de résultats d’édition indésirables ou de réponses cellulaires indésirables. (Voir le tableau ci-dessus pour plus d’informations sur le fonctionnement de l’édition principale.) Des centaines de groupes de recherche utilisent maintenant l’édition principale pour étudier et corriger les mutations dans une grande variété d’organismes, notamment le riz, le blé, le poisson zèbre et les souris.

Après avoir décrit le montage initial pour la première fois en 2019, l’équipe de Liu a continué à développer la technologie. dans le biotechnologie naturelle Dans l’étude, ils ont découvert une vulnérabilité dans les pegRNAs qui réduit l’efficacité. Ils ont découvert que la longue chaîne de ARN A l’extrémité du pegRNA qui code la modification était soumis à une dégradation par les enzymes cellulaires. Les pegRNA dégradés ne peuvent pas arbitrer l’édition initiale et également « empoisonner » le système d’édition principal en bloquant l’accès aux sites cibles par les pegRNA intacts.

Ensuite, les chercheurs ont recherché les structures protectrices qu’ils pourraient ajouter aux pegRNA. Ils ont testé plusieurs séquences d’ARN différentes, identifiant celles qui se replient dans des structures en forme de nœud qui les protègent des enzymes dégradant l’ARN. Lorsqu’ils ont modifié les pegRNA pour inclure des nœuds et des séquences de contact, ils ont observé une augmentation significative de l’efficacité d’édition initiale, indiquant que les nouvelles structures préservaient la matrice d’ARN pour l’édition.

En utilisant des pegRNA modifiés, ou epegRNA, dans un groupe de lignées cellulaires de mammifères, les chercheurs ont constaté que les epegRNA augmentaient l’efficacité d’édition initiale de trois à quatre en moyenne, avec de plus grandes améliorations dans les lignées cellulaires dans lesquelles l’édition initiale était auparavant plus difficile.

Orientation de la cellule vers les éditions initiales

dans le cellule Dans l’étude, l’équipe et les collaborateurs de Liu ont conçu le composant protéique du système d’édition primaire pour augmenter l’efficacité et réduire les sous-produits produits dans un large éventail de types de cellules, y compris les cellules de patients.

Les chercheurs visent à mieux comprendre les facteurs cellulaires qui déterminent les résultats initiaux de l’édition afin de pouvoir concevoir des systèmes plus efficaces. L’équipe soupçonnait que certaines protéines cellulaires actives au cours d’une partie clé du processus d’édition primaire – lorsque la cellule répare les molécules d’ADN créées par les principaux éditeurs – pourraient entraver ou même inverser la modification et augmenter la production de sous-produits indésirables. Pour tester cette hypothèse, les chercheurs ont collaboré avec des équipes dirigées par Brett Adamson, professeur adjoint à l’Université de Princeton. et Jonathan Wiseman, professeur à l’UCSF au début de l’étude, et maintenant professeur au MIT et membre du Whitehead Institute et chercheur au Howard Hughes Medical Institute. À l’aide d’écrans CRISPR basés sur les interférences, les équipes ont systématiquement examiné l’effet de la désactivation de chacun des 476 gènes de réparation de l’ADN différents lors de l’édition initiale.

Sur la base de ces résultats, les chercheurs se sont concentrés sur un processus appelé réparation des mésappariements, qui se produit naturellement dans les cellules pour corriger les mésappariements de l’ADN produits lors de la réplication et de la réparation de l’ADN. Ils constatent que la réparation des non-concordances interfère avec l’édition initiale, réduit l’efficacité de l’édition et augmente la proportion d’insertions ou de suppressions involontaires.

Forte de cette idée, l’équipe a développé de nouveaux systèmes d’édition primaires, qu’ils ont nommés PE4 et PE5, qui incluent une protéine, MLH1dn, que les chercheurs ont conçue pour bloquer temporairement un composant de réparation des mésappariements. Dans les cellules où se produit la réparation des mésappariements, les chercheurs ont découvert que PE4 et PE5 augmentaient considérablement l’efficacité de l’édition et produisaient beaucoup moins de sous-produits par rapport aux systèmes d’édition primaires actuels.

Enfin, les scientifiques ont créé PEmax, qui a amélioré l’architecture et l’amino aigre Séquence de machines de montage primaires. La combinaison des améliorations des systèmes PE4, PE5, PEmax et epegRNAs a entraîné une augmentation de 10 à 100 fois de l’efficacité d’édition par rapport aux systèmes actuels.

« En rassemblant l’expertise de différents groupes de recherche, nous avons pu apprendre comment l’édition initiale fonctionnait et améliorer certaines parties du système », a déclaré Adamson. « Cette étude est un bel exemple de la façon dont la compréhension de base peut conduire la conception expérimentale. »

vers la guérison

Dans de nombreux cas, les améliorations combinées des epegRNAs et du PE4/5/max permettent aux scientifiques de créer plus facilement des modèles cellulaires de la maladie, dit Liu, une étape critique vers le développement de traitements.

L’équipe utilise maintenant ces systèmes pour traiter des modèles cellulaires et animaux de maladies génétiques, et continuera d’explorer la biologie fondamentale de ces systèmes.

« Toutes ces innovations sont synergiques », a déclaré Liu. « Grâce à ces améliorations, nous avons pu modifier efficacement et proprement des types cellulaires importants qui pourraient un jour aider les patients atteints de maladies à composante génétique. Ces résultats suggèrent également qu’il existe d’autres stratégies qui peuvent encore améliorer l’édition initiale. »

Les références:

« Systèmes d’édition primaires améliorés en manipulant des déterminants cellulaires pour modifier les résultats » par Peter J. Chen, Jeffrey A. Hausmann, John Yan, Frederic Nipping, Purnima Ravizankar, Ben Fang Chen, Sidi Chen, James W. Nelson, Gregory A. , Mostafa Şahin, Mark J. Osborne, Jonathan S. Weissman, Brett Adamson et David R. Leo, 14 octobre 2021, cellule.
DOI : 10.1016 / j.cell.2021.09.018

« Les pegRNA conçus améliorent l’efficacité de l’édition initiale » par James W. Nelson, Peyton B. Randolph, Simon B. Sheen, Kelsey A. Everett, Peter J. Chen, Andrew F. Chen, Alvin Hsu et David R. Liu, 4 octobre 2021, disponible ici. biotechnologie naturelle.
DOI : 10.1038 / s41587-021-01039-7

Ce travail a été soutenu par le Merkin Institute for Transformative Technologies in Health Care, les National Institutes of Health, le Howard Hughes Medical Institute, la Fondation Loulou et la Fondation Bill & Melinda Gates.